Die Flugrouten der Trolley Mission sollten sich einerseits auf jene Gebiete erstrecken, die von der 8. US-Luftflotte bombardiert worden waren, aber andererseits auch jene Orte abdecken, die von alliierten Landstreitkräften umkämpft worden waren.
Jeder Flug fand als Nonstop-Flug statt, d.h. nach dem Start auf der Luftwaffenbasis „Wendling Airfield“ in Großbritannien fand keine Zwischenlandung mehr statt. Nach dem Rundflug über Deutschland landeten die Flugzeuge nach einer Flugzeit von sechs bis sieben Stunden wieder auf der Luftwaffenbasis „Wendling Airfield“. An den ersten vier Tagen der Trolley Mission wurde vom 7. bis 10. Mai 1945 die „Südroute“ als Flugstrecke gewählt, während an den beiden letzten Tagen am 11. und 12. Mai 1945 die „Nordroute“ abgeflogen wurde.
Ausgehend von der Luftwaffenbasis „Wendling Airfield“ wurde im Rahmen der Südroute zunächst die ca. 80 km entfernt liegende Stadt Southwold an der britischen Kanalküste angepeilt, da sich dort die letzte Möglichkeit für eine etwaige Notlandung vor der Kanalüberquerung befand. Über dem Ärmelkanal folgten die Flugzeuge dem Steuerkurs auf Ostende in Belgien und flogen südlich von Brüssel auf die Ardennen zu. Vom Ardenner Wald aus flogen die Piloten der Trolley Mission nach Mannheim und Ludwigshafen, was zugleich den südlichsten Punkt dieser Flugroute markierte.
Mit nordöstlichem Kompaßkurs ging es weiter nach Aschaffenburg und Hanau bis Frankfurt am Main. Dem Main flußabwärts folgend wurden Wiesbaden und Mainz überflogen. Sich an der Mündung von Main und Rhein orientierend folgten die Piloten sodann dem Rheinverlauf von Bingen bis nach Koblenz. Da die Flüge der Trolley Mission nach Sichtflugregeln stattgefunden haben, dienten die einst militärstrategischen Angriffsziele nun auch als Bezugs- und Orientierungspunkt für die Piloten, wozu die Brücke in Neuwied sowie insbesondere die Überreste der Brücke von Remagen gehörten.
Dem Rhein weiterhin flußabwärts folgend erreichten die Flugzeuge schließlich die Städte Bonn, Köln und Düsseldorf sowie das südliche Ruhrgebiet. Die Stadt Düsseldorf markierte den nördlichsten Punkt dieser Flugroute, so dass die Piloten von dort aus mit westlichem Kompaßkurs abdrehten und den Rückflug einleiteten, der wiederum über Brüssel, über Ostende sowie schließlich über den Ärmelkanal und Southwold zur Luftwaffenbasis „Wendling Airfield“ führte.
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